摘要: 目的　提高馬爾尼菲青霉菌( PMA) 培養(yǎng)鑒定在基層實(shí)驗(yàn)室的診斷水平。方法　取患者血液或骨髓液置于BacT/ Alert 3D 血培養(yǎng)儀系統(tǒng)配套的成人中和抗生素培養(yǎng)瓶,經(jīng)培養(yǎng)提示陽性,取陽性培養(yǎng)物和淋巴結(jié)組織涂片、革蘭染色鏡檢見病原體有細(xì)長分枝、分隔菌絲、臘腸形菌體, 轉(zhuǎn)種到哥倫比亞血平板、薩布羅瓊脂及CHROMagar 假絲酵母菌顯色培養(yǎng)基,觀察25 ℃和35 ℃孵育時(shí)的菌落形態(tài)及鏡下菌體特征;測試相關(guān)生化反應(yīng),觀察其結(jié)果。結(jié)果　PMA 培養(yǎng)鑒別依據(jù):是雙相型真菌,25 ℃培養(yǎng)為真菌相,35 ℃培養(yǎng)為酵母相,均能產(chǎn)生葡萄酒紅色色素;顯微鏡下菌體形態(tài):25 ℃培養(yǎng)有典型的帚狀枝,35 ℃培養(yǎng)可見圓形、卵圓形、兩端鈍圓略彎曲呈臘腸形有橫隔菌體;生化結(jié)果:都能同化和發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸,脲素酶陽性, 都能被放線菌酮環(huán)己酰亞胺抑制,不能同化發(fā)酵乳糖。結(jié)論　PMA 適宜的培養(yǎng)基是薩布羅培養(yǎng)基,菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)適宜的染色是乳酸棉蘭染色、革蘭染色,適宜基層實(shí)驗(yàn)室開展。

關(guān)鍵詞: 馬爾尼菲青霉菌; 分離; 鑒定; 雙相培養(yǎng)特征

馬爾尼菲青霉菌( Penici l l i um marnef f ei ,PMA) 是馬爾尼菲青霉菌病(penicilliosis marnef2fei ,PSM) 的病原體,主要侵犯單核2巨噬細(xì)胞系統(tǒng)引

起全身廣泛播散性重度深部真菌病,不及時(shí)治療死亡率極高。3 年來,我們通過對120 株P(guān)MA 在鏡檢觀察、生化反應(yīng)、接種在不同培養(yǎng)基及不同孵育溫度生長特點(diǎn)等方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究,總結(jié)出些特點(diǎn),提高了PMA 的分離率和鑒定率。

1 　材料與方法

1. 1 　材料

1. 1. 1 　菌株來源　收集2005 年12 月- 2008 年11月我院經(jīng)雙相培養(yǎng)證實(shí)的PMA 菌株120 株,標(biāo)本種類:血液114 例,淋巴結(jié)組織3 例,骨髓3 例。剔除同患者相同標(biāo)本分離到的重復(fù)菌株。120 例全是住院AIDS 患者,其中男性96 例,女性24 例,年齡在18 月齡～80 歲,平均38. 5 歲。

1. 1. 2 　儀器設(shè)備　Bac T/ Alert3D 血培養(yǎng)儀、GZX2DH 電熱孵育箱、二生物安全柜(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)、OL YMPUSI2BX51系統(tǒng)顯微鏡。

1. 1. 3 　主要培養(yǎng)基和試劑　Bac T/ Alert 3D 全自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng)配套的培養(yǎng)瓶,哥倫比亞瓊脂干粉,薩布羅培養(yǎng)基(SDA) 干粉等。

1. 2 　方法　

(1) 標(biāo)本前處理:血液標(biāo)本由病房護(hù)士采集血液8～10 ml 接種成人中和抗生素培養(yǎng)瓶、骨髓由病房醫(yī)師采集0. 2～1 ml 注入如上培養(yǎng)瓶中、淋巴結(jié)組織由病房采集裝入無菌管中,以上標(biāo)本要求在30 min 內(nèi)送至微生物室。

(2) 標(biāo)本培養(yǎng):血培養(yǎng)瓶直接放入Bac T/ Alert 3D 血培養(yǎng)儀進(jìn)行培養(yǎng)。真菌培養(yǎng)基和生化管用標(biāo)準(zhǔn)菌株A TCC 10231 白色假絲酵母菌做質(zhì)控合格后使用。

(3) 菌株同化試驗(yàn):用API 20C AUX 鑒定條按說明書提示操作步驟操作。

(4) 各種染色與試驗(yàn): 革蘭染色、PAS 染色、乳酸棉蘭染色、HE 染色按《全臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(3 版) 操作。

(5) 試驗(yàn)方法:尿素水解試驗(yàn)、放線菌酮環(huán)己酰亞胺耐受試驗(yàn)和硝酸鹽同化試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[ 1 ]操作。凡是接種、涂片及觀察結(jié)果均在生物安全柜中操作。

2 　結(jié)　果

2. 1 　陽性時(shí)間觀察結(jié)果　血培養(yǎng)瓶直接放入Bac T/ Alert3D 血培養(yǎng)儀進(jìn)行培養(yǎng),檢出陽性時(shí)間觀察:24 h 內(nèi)為8 例,24～48 h 為46 例,48～72 h 為53 例。72 h 后為10 例,平均53 h ,陽性檢出曲線呈緩慢抬高趨勢。

2. 2 　兩種溫度孵育下不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)

2. 2. 1 　25 ℃培養(yǎng)特征　菌落呈真菌相。

2. 2. 1. 1 　薩布羅瓊脂斜面培養(yǎng)基　2 d 可見生長,菌落初期呈白色、灰白色或褐色菌落,中間有少許絨毛出現(xiàn),菌落直徑約有2～5 mm ;3～5 d ,菌落呈絨毛狀,顏色可有白色、灰色、黃色、紅色,常見中間為黃色或粉紅色周圍為灰白色, 菌落直徑約有5 ～12 mm ,菌落下面及周圍出現(xiàn)酒紅色;10～15 d ,菌落的絨毛逐漸出現(xiàn)融并慢慢趨向紅色;30 d 后,絨毛融成片呈紅色,整個(gè)培養(yǎng)基變成葡萄酒紅色。

3 　討　論

　　馬爾尼菲青霉菌屬于青霉菌屬,是該菌屬中惟的雙相型真菌 ,全球約十多個(gè)家和地區(qū)發(fā)現(xiàn)PMA 感染者,尤其以中南部和東南亞居多,而在泰北部已成為艾滋病患者的3 位常見機(jī)會(huì)菌感染。近10 年來,在我的南方隨著HIV 患者增加,AIDS 合并PSM 越來越常見,臨床表現(xiàn)與HIV

患者感染肺結(jié)核、組織胞漿菌或隱球酵母菌相似,呈隱匿或急性,潛伏期尚未完全確定。PMA 菌適宜的培養(yǎng)基是薩布羅培養(yǎng)基,也是真菌培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基。針對PMA 的染色大多推薦PAS 染色而PAS 染色操作復(fù)雜,技術(shù)要求較高。通過觀察比較,認(rèn)為菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)適宜的染色是乳酸棉蘭染色、革蘭染色。